2019年10月14日，中國科學院生物物理研究所徐濤院士課題組與徐平勇課題組合作，在《Nature Methods》上發(fā)表了題為 “mEosEM withstands osmium staining and Epon embedding for super-resolution CLEM” 的研究論文。他們發(fā)展了第一個常規(guī)電鏡制樣后保持熒光的光轉化熒光蛋白，首次實現(xiàn)了Epon后固定的同層超薄樣品的超分辨光鏡-電鏡關聯(lián)成像，極大地促進了超分辨光鏡和電鏡成像領域的發(fā)展，有望帶來生物學中的廣泛應用。

蛋白質等分子在細胞中的特定位置組裝成蛋白質機器進而發(fā)揮生物學功能，因此研究蛋白質等分子在細胞中的精確定位對于揭示蛋白質機器的組裝和分子機制至關重要。電子顯微鏡具有亞納米尺度的空間分辨率，是生命科學領域中不可缺少的研究工具。然而在電鏡圖像中定位目標蛋白具有很大的挑戰(zhàn)。例如常用的免疫電鏡利用抗原—抗體反應在電鏡圖像中標記和定位蛋白質，該方法標記效率低，而且對抗體的特異性依賴性很大。近年來出現(xiàn)的光鏡-電鏡關聯(lián)成像技術是一種雙模態(tài)成像技術，該技術利用光鏡成像來定位目標分子，標記效率和特異性高，同時還可利用電鏡對細胞進行超微結構成像。超分辨光鏡-電鏡關聯(lián)是更先進的光電關聯(lián)技術，其中超分辨光鏡打破了光學衍射極限，將成像的空間分辨率提高到幾十納米。

光電關聯(lián)技術的核心難點是電鏡制樣后熒光分子無法保持熒光。當前光電關聯(lián)成像一般是先用光鏡對整個細胞成像，然后再固定和包埋電鏡制樣，導致電鏡成像中不容易找到光鏡圖像中的同一細胞，而且整體細胞的光鏡圖像與超薄切片的電鏡圖像關聯(lián)不準。常規(guī)電鏡制樣方法，包括使用1% 鋨酸固定來保持細胞的超微結構和電鏡襯度，以及使用Epon包埋來保證樣品的切片質量，能夠獲得高質量的電鏡圖片，并可應用于大尺度生物樣品如腦組織的連續(xù)切片和3D重構。因此，急需發(fā)展抗鋨酸固定和Epon包埋的熒光蛋白，在電鏡制樣的超薄切片中保持熒光，實現(xiàn)真正的光電關聯(lián)。

本研究中，團隊成員發(fā)展了第一個抗鋨酸固定和Epon包埋的熒光蛋白，該熒光蛋白在電鏡制樣后仍然保持熒光并具有光開關的活性，通過優(yōu)化超薄切片中單分子定位算法和成像方法，首次實現(xiàn)了Epon后固定電鏡樣品的同層超分辨光鏡-電鏡關聯(lián)成像。該光電關聯(lián)成像方法很好地保留了電鏡圖像中線粒體等亞細胞結構，并具有單分子定位超分辨光鏡成像的單分子定位精度。利用該技術合作團隊成功實現(xiàn)了線粒體和核膜的光電關聯(lián)成像（圖1）。該熒光蛋白將在神經以及腦科學等需要對大尺度厚樣品進行連續(xù)切片和3D重構的光電關聯(lián)中得到廣泛應用。

徐濤院士領銜的儀器研發(fā)團隊近年來致力于顯微成像儀器設備和技術方法的研究和開發(fā)，先后研制出偏振單分子干涉成像、冷凍單分子定位成像以及超分辨光電融合成像系統(tǒng)，開發(fā)了多種新的超分辨顯微成像方法。徐平勇課題組主要致力于發(fā)展多種用于超分辨成像如PALM/STORM、SOFI、SIM等的探針，并基于探針的光化學特性發(fā)展新的成像方法如貝葉斯單分子超分辨成像方法SIMBA等，來提高超分辨成像的時空分辨率。該工作是徐濤院士課題組/徐平勇課題組合作，繼PALM成像探針mEos3.2（Nature Methods，2012）、活細胞超分辨成像方法Quick-SIMBA（Nano Letter，2019）后在超分辨成像領域取得的又一重要研究成果。

徐濤院士、張名姝副研究員和徐平勇研究員為該文章的共同通訊作者，付志飛、彭鼎銘、張名姝為共同第一作者。

該工作受到國家重點研發(fā)計劃、國家自然科學基金、中科院先導專項、中科院科研儀器設備研制項目、以及北京市科技計劃等項目的資助。